贺倩倩1，李耀耀1，曹毅2，杨晓红2，吴蓓玲2(1．浙江中医药大学;2．浙江中医药大学附属第一医院)

摘要:目的:研究祛斑汤对HaCat细胞、黑素细胞的抑制作用及对SCF/C－kit蛋白表达水平的影响，探讨SCF/C－kit信号通路与黄褐斑发病机制的相关性。方法:MTT法观察0、5、15、25、50、100mg/mL浓度祛斑汤对HaCat细胞、黑素细胞的抑制情况，选取最佳抑制浓度;根据最佳抑制浓度，将Hacat细胞分为1640培养基组、0.03J/cm2UVB照射组、15mg/mL祛斑汤组、0．03J/cm2UVB照射+15mg/mL祛斑汤组，黑素细胞分为MelM－2培养基组、0．03J/cm2UVB照射组、25mg/mL祛斑汤组、0．03J/cm2UVB照射+25mg/mL祛斑汤组;Westernblot法检测各组Hacat细胞SCF蛋白表达水平，各组黑素细胞的C－kit受体蛋白表达水平。结果:祛斑汤呈浓度依赖性抑制Hacat细胞/黑素细胞增殖，15mg/mL时对Hacat细胞的抑制效应达到峰值(P＜0．01)，25mg/mL时对黑素细胞的抑制效应达到峰值(P＜0．01);祛斑汤抑制Hacat细胞SCF蛋白的表达和黑素细胞C－kit受体蛋白的表达，并下调UVB对HaCat细胞、黑素细胞SCF、C－kit蛋白表达的促进作用。结论:祛斑汤能有效抑制Hacat细胞、黑素细胞的增殖，可能与抑制SCF/C－kit信号途径的SCF、C－kit蛋白表达有关。

关键词:祛斑汤;黄褐斑;HaCat细胞;黑素细胞;SCF/C－kit信号途径

黄褐斑(Melasma)是一种获得性色素沉着皮肤病，临床以面部对称性黄褐色色素沉着为主要表现，多见于中青年女性，易伴有不同程度的月经失调、烦躁易怒、失眠等症状，给患者带来较大的生活和精神压力。近年来，本科自拟祛斑汤治疗黄褐斑取得良好的临床疗效。但是黄褐斑的发病机理十分复杂，真正的发病原因尚不十分清楚，多数学者认为，黄褐斑皮肤色素加深主要是由于皮肤中的黑素颗粒增多引起的［1］，干细胞因子(stemcellfactorSCF)和C－kit受体是其中一对重要的细胞因子，在黑素代谢中起关键作用［2－4］。研究证明，UVB照射可以引起皮肤色素沉着，一定剂量的UVB照射可以促进黑素细胞增殖，增加黑素合成［5］。本研究拟通过观察UVB、祛斑汤处理下Hacat细胞/黑素细胞SCF和C－kit蛋白的表达情况，探索祛斑汤治疗黄褐斑的可能机制。

1仪器和试剂

1．1仪器

超净工作台(上海净化，型号:SW－CJ－2F)、CO2培养箱(ThermoForma，型号:3111)、倒置显微镜(COIC，型号:XJP－2/3)、超纯水仪(ThermoForma，型号:EASYpureＲo-Di)、电泳仪及电泳槽(BIO－ＲAD，型号:PowerPac系列)、凝胶成像系统(BIO－ＲAD，型号:GelDocTMXＲ)、低温高速离心机(ThermoForma)、低温冰箱(SANYO)、电子天平(MettlerToledo，型号:AL204/01)，液氮罐(ThermoForma)、细胞培养瓶(Corning)、96孔培养板(Corning)等。

1．2试剂

祛斑汤由柴胡12g，当归12g，菟丝子15g，益母草30g，川芎12g，丹参30g，白茯苓15g，白芷6g，白僵蚕9g，枸杞子15g，制首乌30g，桑白皮12g组成，所需中药成分由浙江省中医院中药制剂室提供。兔抗人SCF抗体(美国Pepro-Tech公司)、兔抗人多克隆β－actin抗体(博奥森生物有限公司)、兔抗人C－kit抗体(上海优宁维生物科技有限公司)、生物素标记数二抗(鼠抗兔IgG)(杭州达文生物有限公司)、1640(hyclone)、胎牛血清(美国Invitrogen公司)、0．25%胰酶/EDTA(美国Invitrogen公司)、四甲基偶氮唑蓝(MTT)(美国Sigma公司)、BCA蛋白定量试剂盒(普利莱基因技术有限公司)、ECL显色试剂盒(BiologicalIndustries)。

2试验方法

2．1Hacat细胞/黑素细胞的培养和传代

2．1．1Hacat细胞的培养和传代Hacat细胞的培养液为含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液，将细胞(本科室长期保存)培养于37℃、5%CO2恒温饱和湿度培养箱，显微镜下观察细胞生长情况，是否污染，是否有细胞悬浮等;待细胞融合约瓶底85%～95%状态时，吸去瓶内培养液，PBS洗涤两次，加入胰酶适量，37℃孵育5min，吸掉胰酶，加入2mL培养液终止消化，反复吹打成使贴壁细胞悬浮于培养基中，然后转移至15mL离心管，800r/min，离心5min，弃上清，加培养液，反复吹打，使细胞悬浮均匀，以1∶3的比例接种到培养瓶中。温饱和湿度培养箱。

2．1．2黑素细胞的培养和传代黑素细胞购自美国scien-cell公司，培养液为含有2．5%胎牛血清的MelM－2培养液，余处理方式同Hacat细胞。

2．2Hacat细胞、黑素细胞的UVB处理将对应组细胞用30mJ/cm2UVB预照射30min后再用不同浓度祛斑汤提取液处理。

2．3药物的配制和贮存

祛斑汤:取祛斑汤中药成分加相当于药材量10倍的蒸馏水浸泡2h，第一次回流提取1．5h，滤过后药渣再加10倍量水继续提取1h，合并2次滤液，于水浴上浓缩定容至每mL相当于原方生药材1g的药液，离心去渣，－20°冰箱低温保存。

2．4检测Hacat细胞、黑素细胞增殖

2．4．1Hacat细胞先检测能使Hacat细胞增殖的祛斑汤的最佳浓度。将Hacat细胞以1×105/mL的密度种植于96孔板，每孔100μL，分为0、5、10、25、50、100ng·mL－15组，每组6个复孔，置于5%CO2、37℃恒温培养箱中培养24h，待细胞铺满培养孔底部60%～70%时，吸除培养液，用PBS冲洗两次，分别加入用PBS配成的0、5、10、25、50、100ng·mL－1的祛斑汤，继续培养24h后吸除培养液，每孔加入20μL用PBS配成的MTT(5mg·mL－1)，放置于5%CO2、37℃恒温培养箱中3h，去培养液，加入150(lDMSO后震荡10min，置于酶标仪570nm读取吸光度值，比较各组OD值，选取最佳浓度。

2．4．2黑素细胞黑素细胞的增殖检测同Hacat细胞。

2．5Hacat细胞、黑素细胞的SCF/C－kit蛋白检测设立DMEM培养基组、0．03J/cm2UVB照射组、15mg/mL祛斑汤组、0．03J/cm2UVB照射+15mg/mL祛斑汤组，取对数生长期Hacat细胞，待细胞铺满培养瓶70%时，根据分组对其进行处理，继续培养24h。吸除培养液，用PBS冲洗两次;细胞刮刷刮瓶底细胞，然后用移液器将细胞碎片转移至1．5mLEP管中，4℃、12000r/min、5min离心，弃上清;每个EP管加入300μLＲIPA细胞裂解液，冰上均匀裂解30min;裂解完成后用BCA法测定蛋白浓度。根据所测蛋白浓度，计算40μg溶液蛋白的体积为上样量。将40μg样品蛋白SDS－PAGE电泳后转印至PVDF膜上，封闭后加入相应的一抗(用5%脱脂奶粉封闭液稀释过的SCF、β－actin抗体，稀释度为1∶1000)，4℃过夜孵育。一抗反应结束后，用1×TBST在摇床上室温洗3次，每次10min;再加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗(稀释度为1∶1000)，室温孵育2h，二抗孵育结束后用1×TBST在摇床上室温洗3次，每次10min;最后用ECL试剂盒显影拍照。再用同样的方法检测黑素细胞的C－kit蛋白表达。

2．6数据统计

计量资料以珋x±s表示;使用SPSS17．0软件进行统计，组间比较采用t检验，相关性采用Pearson分析，P≤0．05为差异有统计学意义;采用SDS软件、Biorad软件、GraphPadPrism5．0进行数据图像处理。

3结果

3．1不同浓度祛斑汤对Hacat细胞增殖的影响MTT法检测不同浓度祛斑汤对Hacat细胞增殖的影响结果显示，对照组OD值最高，其他不同浓度祛斑汤OD值均低于对照组;5mg/mL的祛斑汤即可抑制HaCat细胞增殖，15mg/mL祛斑汤的抑制效应基本达到最大值(P＜0．01)，当浓度＞15mg/mL时，显微镜下可见Hacat细胞坏死、脱落，浓度越高，细胞坏死脱落越明显。见图1。



祛斑汤组黑素细胞C－kit蛋白表达情况，与培养基组相比，UVB能促进黑素细胞C－kit蛋白表达，祛斑汤明显抑制细胞C－kit蛋白表达，同时抑制UVB促进黑素细胞C－kit蛋白表达能力。本实验重复3次，结果相似。见图4。

4讨论

黄褐斑，中医认为与肝、脾、肾三脏密切相关，主要病机为气滞血瘀、肝肾不足、脾虚湿停等。肝主藏血、疏泄调达，疏泄功能失常，气机不畅，郁而气滞，气滞则血瘀;肝藏血、肾藏精，肾阴不足，精血亏虚，虚火上炎，火燥熏蒸颜面成黑斑;胃主受纳，脾主运化，脾胃虚弱，水谷精微化生失常，水饮停滞，气血不和，不能上荣于皮肤，发为黄褐斑。《外科证治全书·面部证治·面尘》云:“面色如尘垢，日久煤黑，形枯不泽。或起大小黑斑，与面肤相平。由忧思抑郁，血弱不华。外用玉容散，……内宜疏胆气兼清肝，加味归脾汤送六味地黄丸主之……”。

本科观察了祛斑汤联合还原型谷胱甘肽静滴治疗135例黄褐斑患者，有效率高达84．5%，明显高于口服维生素E、维生素C、胱氨酸的对照组［6］。祛斑汤由柴胡12g，当归12g，菟丝子15g，益母草30g，川芎12g，丹参30g，白茯苓15g，白芷6g，白僵蚕9g，枸杞子15g，制首乌30g，桑白皮12g组成，临床上用于黄褐斑治疗，疗效明确。本方柴胡疏肝理气，川芎、当归、丹参、益母草养血活血，白茯苓、桑白皮、白芷、白僵蚕健脾理湿、祛风利水，菟丝子、枸杞子、制首乌补益肝肾，滋阴养血，全方共奏疏肝解郁，补肝益肾，调和气血，活血化瘀之功。陈仁康发现化瘀消斑汤配合外用洗面方治疗黄褐斑有明显效果，有效率达85%［7］。杜柯［8］的研究指出柴胡内含有丰富的柴胡多糖，具有良好的抗衰老、抗氧化作用;张建华等［9－10］研究表明白芷，白茯苓、当归、川芎、白僵蚕的萃取物对酪氨酸酶有不同的抑制作用;应军等［11］指出丹参提取液能提高机体抗氧化能力，抑制TYＲ活性，减少黑色素的合成以及改善机体的血液流变学，达到防治黄褐斑的功效。

中医药治疗黄褐斑在临床上取得了一定的疗效，但也存在一些难题。国内对于中医药治疗黄褐斑的研究多局限在病案分析、专家经验报告等回顾性研究，缺乏对其病因病机的前瞻性研究。西医认为人类皮肤色素沉着过程主要为成熟的黑素小体合成黑素，黑素小体向树突远端转移、传递至邻近角质形成细胞，然后在角质形成细胞内分布和降解。在这一过程中，黑素颗粒合成增多、黑素颗粒从黑素小体向邻近角质形成细胞转运减少及角质形成细胞新陈代谢下降都有可能引起皮肤中黑素颗粒的增多，但其真正的机制尚未明确。Hachiya等发现经UVB照射后，培养的角质形成细胞和黑素细胞的SCF和C－kit受体的基因水平和蛋白水平量均显著增加;阻断SCF/KIT途径后，紫外线照射不再引起豚鼠皮肤黑素细胞增加。潘建英等［5］实验研究发现0～0．06J/cm2UVB能激活酪氨酸酶和促进黑素细胞的黑素合成。这些实验结果都说明了SCF/KIT途径在紫外线引起黑素细胞增生、色素沉着中的关键作用。

本实验通过研究祛斑汤对HaCat细胞/黑素细胞的抑制作用及对SCF/C－kit蛋白表达水平的影响，发现祛斑汤呈浓度依赖性抑制Hacat细胞/黑素细胞增殖，15mg/mL时对Hacat细胞的抑制效应达到峰值(P＜0．01)，25mg/mL时对黑素细胞的抑制效应达到峰值(P＜0．01)，且抑制Hacat细胞SCF蛋白的表达和黑素细胞C－kit受体蛋白的表达，并下调UVB对HaCat细胞/黑素细胞SCF、C－kit蛋白表达的促进作用。由此，笔者推测祛斑汤治疗黄褐斑的机制可能与SCF/C－kit信号通路有关，本实验为其临床治疗黄褐斑提供了有力的实验依据。

参考文献

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［6］余土根，郑益志．祛斑汤联合泰特治疗黄褐斑的疗效观察［J］．中国麻风皮肤病杂志，2005，21(7):539－540．

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［8］杜柯，孙润广，赵凯．柴胡多糖的结构和抗氧化活性分析［J］．生物加工过程，2011，9(4):45－48．

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［11］应军，倪庆纯，杨威，等．杭白菊、当归、丹参提取液抑制黄褐斑形成及机制研究［J］．中草药，2011，42(5):958－962．